西元 1962 年，Francis Crick、James Watson、Maurice Wilkins 博士以解開 DNA 結構並闡釋 DNA 結構生物功能的貢獻榮獲諾貝爾生理醫學獎 [1]。在 1970 年，Francis Crick 博士更提出了中心法則 (central dogma)，其在維持細胞恆定以及執行功能時扮演至關重要的角色 [2]。中心法則是指 DNA 一路經過轉錄 (transcription) 成 RNA，到轉譯 (translation) 後變成可以執行正常功能的蛋白質的過程。然而此過程必須經過精準的調控，否則很容易干擾基因體的穩定性 (genome stability)、破壞細胞的恆定，甚至導致疾病 [3]。
DNA 除了會透過轉錄轉換成 RNA，其也會透過複製 (replication) 合成與原本的 DNA 序列近乎百分之百相同的子代 DNA，以作為後續轉錄的基礎。然而這兩個過程都會發生在染色質 (chromatin) 上，且複製起點常與轉錄起始點非常靠近，因此當兩個過程發生時間非常相近時，會有衝突的可能性，此稱為「轉錄-複製衝突 (transcription-replication collisions; TRCs)」，並對複製過程造成極大的障礙，進而形成複製壓力 (replication stress) 與促進基因體的不穩定性 (genome instability) [4]，且基因體的不安定性為細胞癌化的主要推手之一 [5]，因此透過研究 TRCs 的形成原因便有機會作為治療癌症的基礎。本篇文章便要介紹美國范德堡大學 (Vanderbilt University) David Cortez 教授的研究團隊於 2023 年 6 月發表了在 TRCs 領域的重要發現 [6]。
為了研究 TRCs，團隊將研究重點聚焦在參與轉錄過程的一個重要蛋白 – Integrator 蛋白複合物 (INT)，其為人所知的功能是與 RNA 聚合酶 II (RNA polymerase II; RNAPII) 之間的交互作用，並調控正在轉錄中的 RNA 的裁剪 (cleavage)，因此團隊透過人為基因敲落 (knockdown)，將 INT 蛋白中具有核酸內切酶活性的次單位 INTS11 的表現量下降 ，並透過實驗觀察 INTS11 表現量的差異之於 DNA 複製與 TRCs 的重要性。團隊首先發現如果敲落人類癌細胞中的 INTS11 蛋白，會出現 DNA 傷害的特徵 (DNA damage)。此外，團隊透過 DNA 纖維實驗 (DNA fiber assay) 量測 DNA 複製速度，發現低 INTS11 蛋白表現量會使 DNA 複製減速 (圖一 A)。染色質分離實驗的結果也證實，降低 INTS11 蛋白的表現，會使 RNAPII 持續停留在染色質上 (圖一 B)，成為 DNA 複製的路障。
圖片來源：https://doi.org/10.1016/j.molcel.2023.05.015
上述的結果使團隊認為，INT 蛋白複合物可能與 DNA 複製有直接關聯，因此團隊透過研究細胞週期中 DNA 複製期 – S 期 (S phase) 中，INT 蛋白與其他 DNA 複製的相關蛋白之間的潛在交互作用，進而驗證 INT 在 DNA 複製的角色。團隊利用先前開發的新生 DNA 上蛋白質分離法 (isolation of proteins on nascent DNA; iPOND) [7]，觀察正在行進中的 DNA 複製叉 (progressing replication fork) 上的蛋白質，結果顯示 INT 蛋白與 DNA 解螺旋酶 (helicase) 有直接的交互作用，證實了 INT 蛋白可以直接調控 DNA 複製，但實際作用的機制仍未知。
最後團隊試圖研究 INT 蛋白之於 TRCs 的重要性，然而 TRCs 又可分類為同方向碰撞 (co-directional; CD，意指轉錄與複製前進方向同向) 以及正面碰撞 (head-on collisions; HO，意指轉錄與複製前進方向相反) (圖二)，因此團隊在研究 TRCs 時為了分開討論 HO 與 CD，採用了先前發表過的「游離系統 (episomal system)」[8]，這套系統可以在細胞中分別誘導 HO TRCs 以及 CD TRCs。透過游離系統，團隊證實了 INT 蛋白的缺失會導致同方向的轉錄-複製衝突 (CD TRCs)，並直接導致染色體的斷裂與基因體的不穩定性 (圖三)。
圖片來源：https://doi.org/10.1016/j.molcel.2023.05.015
圖片來源：https://doi.org/10.1016/j.molcel.2023.05.015
透過上述結果，團隊認為 INT 蛋白可以透過移除染色質上的 RNAPII，並且與 DNA 解螺旋酶的交互作用，進而確保 DNA 複製的順利進行並避免 TRCs 的發生 (圖四)。在過往的研究分析中，INT 蛋白被證實會在某些腫瘤類型中過量表現 [9]，因此，這篇研究的結果也提出一個可能性，如果可以透過藥物或是其他方式抑制癌細胞中 INT 的表現，便有機會擾亂其基因體的穩定性，並有望作為未來發展癌症治療的線索。
圖片來源：https://doi.org/10.1016/j.molcel.2023.05.015
參考文獻：
1. The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1962. NobelPrize.org. Nobel Prize
2. CRICK, F. Central Dogma of Molecular Biology. Nature 227, 561–563 (1970). https://doi.org/10.1038/227561a0
3. Stranger, B. E., & Dermitzakis, E. T. (2006). From DNA to RNA to disease and back: The ‘central dogma’ of regulatory disease variation. Human Genomics, 2(6), 383. https://doi.org/10.1186/1479-7364-2-6-383
4. Gómez-González, B., & Aguilera, A. (2019). Transcription-mediated replication hindrance: a major driver of genome instability. Genes & development, 33(15-16), https://doi.org/10.1101/gad.324517.119
5. Gaillard, H., García-Muse, T., & Aguilera, A. (2015). Replication stress and cancer. Nature Reviews Cancer, 15(5), 276-289. https://doi.org/10.1038/nrc3916
6. Bhowmick, R., Mehta, K. P., Lerdrup, M., & Cortez, D. (2023). Integrator facilitates RNAPII removal to prevent transcription-replication collisions and genome instability. Molecular Cell. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2023.05.015
7. Sirbu, B. M., Couch, F. B., Feigerle, J. T., Bhaskara, S., Hiebert, S. W., & Cortez, D. (2011). Analysis of protein dynamics at active, stalled, and collapsed replication forks. Genes & development, 25(12), 1320-1327. http://doi.org/10.1101/gad.2053211
8. Hamperl, S., Bocek, M. J., Saldivar, J. C., Swigut, T., & Cimprich, K. A. (2017). Transcription-replication conflict orientation modulates R-loop levels and activates distinct DNA damage responses. Cell, 170(4), 774-786. https://doi.org/10.1016/j.cell.2017.07.043
9. Federico, A., Rienzo, M., Abbondanza, C., Costa, V., Ciccodicola, A., & Casamassimi, A. (2017). Pan-cancer mutational and transcriptional analysis of the integrator complex. International journal of molecular sciences, 18(5), 936. https://doi.org/10.3390/ijms18050936
撰文｜蕭皓文 (東京大學 新領域創成科學研究科 計算生物學與醫學科學專攻 博士班)
審稿｜藍冠鈞 (京都大學 醫學研究科 醫學專攻 博士班)
Japan-Taiwan Biotech Association (JTBA) 
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